NeuraLynx在体多通道采集系统自由活动绵羊深部脑电生理学

我们首次描述了绵羊在网络动力学层面（通过局部场电位 [LFP]）和单神经元层面的几种电生理特征。这些特征包括大脑皮层（CTX）中的振荡网络动力学（如 α 波段振荡）和海马体（HPC）中的振荡网络动力学（如 θ 波和锐波涟漪 [SWR] 振荡），这些特征在很大程度上与在其他哺乳动物物种中观察到的特征相似。此外，我们观察到一些单神经元会受到认知任务表现的调节，这些神经元会因奖励和对决策点的预期而受到不同的调节。最后，我们在海马体中发现了位置细胞，其中包括一个会受到绵羊饲养员视野影响的位置细胞。能够长时间对单神经元进行稳定记录，为在自然环境中研究大脑功能创造了新的机会。

二、结果 本研究采用两只威尔士山地绵羊（母羊，植入装置时年龄分别为17和19个月，体重分别为35.0与36.0千克，安乐死时体重分别为45.5与45千克）。记录使用四极管微驱动阵列（图1A-1D），分别在绵羊1和2颅骨外外侧回背侧植入16和24个四极管阵列（详见STAR方法；图S1A-S1D）。测试期间通过连接线将绵羊与记录系统耦联，保证其在实验围栏内自由活动（图1E-1H；视频S1-S4）。标准记录流程始于基线记录阶段，此时绵羊被限制在行为围栏外。随后进入主动行为期，通常在实验围栏内进行认知测试（图1E；视频S1-S2）或探索/觅食行为（图1F）。每次记录均包含后测阶段，此阶段限制绵羊活动以记录静息态脑电活动并推进电极。图1I-1J展示了皮层（CTX）与海马结构（HPC）四极管记录的局部场电位（LFP）与多单元放电活动（滤波波形见图S1E-S1H）。为实现CTX与HPC同步记录，部分四极管固定于皮层，其余则推进至海马结构。在静息状态下（图1I），皮层呈现节律性LFP，而海马以缓慢不规则活动为主；运动期间皮层节律性减弱，海马则出现显著振荡（详见图示定量分析）。实验结束后通过电解损伤标记部分四极管最终位置，并经组织学检验验证电极定位（图1K-1L）。

图1. 自由活动绵羊单神经元和局部场电位记录的装置及实验步骤

(A 和 B) 植入前的定制 22 四极管微推进器组件，显示四极管终止于两个套管中（黑色箭头）（A）。微推进器安装在一个 3D 打印的腔室中（B），该腔室固定在颅骨上。(C 和 D) 在记录过程中，取下保护壳的盖子（B 中的∗处），并安装一个用于固定记录电缆并保护连接的金属框架（C）。在术后护理和恢复期间，使用伊丽莎白圈进一步保护植入物和手术切口（D）。(E 和 F) 在记录过程中，绵羊要么执行二选一辨别任务（E），要么在活动区域的地面上觅食散落的食物颗粒（F）。(G) 示意图展示了上方摄像头（t1–t4）的位置，这些摄像头用于记录绵羊在活动区域内的位置，以及一个根据移动速度进行颜色编码的位置跟踪示例轨迹（颜色刻度对应 0–200 厘米 / 秒）。(H) 实验活动区域的鸟瞰图，显示了用于二选一辨别测试的四台电脑显示器的位置（黄色箭头）。(I 和 J) 约束状态下（I）和移动状态下（J）大脑皮层（CTX）和海马体（HPC）的局部场电位示例轨迹。另见图 S1E–S1H。每条轨迹下方的垂直标记表示假定的尖峰事件。（I）中的红色星号表示一个锐波涟漪事件。(K 和 L) 在实验结束时用于验证大脑皮层（K）和海马体（L）中电极位置的组织切片示例。CTX，大脑皮层；HPC，海马体。另见图 S1 和视频 S1、S2、S3 和 S4。

视频 S1. 二选一辨别测试期间实验活动区域的上方视角，同时进行电生理记录，与图 1 相关

可以看到绵羊（绵羊 2 号）有时在经过一番思考后，接近两个刺激 / 奖励位置中的一个。当选择错误时（黑色背景上的白色三角形形状），会听到高音调的声音，而在每次新试验开始时会听到另一个较低音调的声音。在做出正确选择（旋转 90 度的拉丁字母 “L”）之后立即听到的声音，是在局部屏幕显示器下方发放奖励的声音。

视频 S2. 绵羊 2 号接近正确刺激屏幕时的特写画面，与图 1 相关

可以清楚地看到与头部植入物相连的系绳以及用于追踪的发光二极管（LED）。同时，还能看到食物颗粒发放盒上方的光学传感器。

视频 S3. 连续二选一辨别测试，同时展示电生理轨迹画面，与图 1、图 6 和图 S7 相关

在此视频中，可以看到绵羊 1 号在进行电生理数据采集期间执行连续二选一辨别任务。在房间的另一端，还能看到两台正在显示所采集数据的电脑显示器。除了能听到的提示音外，还能听到来自海马体四极管的神经元放电活动的声音。在第 38 秒时，可以听到来自一个假定位置细胞的放电活动，并且在最右边的电脑屏幕上也能看到该放电活动。

视频 S4. 绵羊 2 号在进行简化二选一辨别测试时的画面，同时展示电生理轨迹，与图 1 和图 6 相关

绵羊 2 号正在执行一个更简化版本的二选一辨别任务，它需要接近显示有符号的屏幕，而不是空白屏幕。电脑显示器上显示的是局部场电位轨迹，上面叠加了来自海马体四极管的神经元放电事件。在绵羊开始移动时，可以明显看到一个清晰且突出的振荡（θ 波频段范围内）出现。

2.1. 对自由活动的绵羊进行稳定的细胞外记录是可行的

研究人员在数月时间里（分别从绵羊 1 号和绵羊 2 号身上记录了约 8 个月和 6 个月），每天对两只绵羊进行记录，在此期间，我们总共识别出了 3308 个假定的单神经元（图 2）。每天，我们通常能够同时记录多个神经元的活动（见图 2A 中一个示例四极管的聚类情况、图 2B 中相关的波形以及图 2C 中的示例自相关图）。在一天内识别出的假定单神经元（以下简称神经元）的最大数量为 36 个。绵羊 1 号的平均数量为 10.6±0.5 个，绵羊 2 号的平均数量为 16.5±0.7 个。根据 L 比率和隔离距离指标评估（图 2D），细胞记录的质量与先前文献中报道的相符。由于没有绵羊神经元的细胞内记录可供比较，我们选择根据超极化后电位持续时间（dap），将假定的神经元细分为两大类，就像之前对非人类灵长类动物、啮齿动物或豚鼠的记录所做的那样。因此，我们将细胞分为窄峰神经元（dap＜225 毫秒）和宽峰神经元（dap＞250 毫秒）（图 2E 和图 2F）。处于这两类之间过渡区域的细胞将单独处理（详见后文）。一小部分看起来高度对称的神经元被归类为潜在的 “轴突” 事件（图 2F，插图）。平均放电率大多较低，大多数细胞（约 80%）的放电率在 5 赫兹或以下（图 2G），而根据前面提到的分类，基于该分类的放电率显示，窄峰神经元类别中出现较高放电率的概率在统计学上显著高于宽峰神经元类别（图 2H）。后一观察结果与一种能够区分主要的锥体细胞和神经元内细胞的分类方法相一致。

图 2. 绵羊大脑皮层和海马体神经元细胞外记录的特征

(A) 四极管的一个记录示例，显示已识别出的七个单细胞簇。(B) 与 (A) 中所示细胞簇相对应的平均尖峰波形（在四极管的四根导线各自上的波形）。(C) 来自 (A) 中记录的两个单细胞的示例自相关图。(D) 使用两只绵羊的记录绘制的细胞簇质量特征（隔离距离和 L 比率）分布。(E) 图表展示了根据细胞外波形形状特征绘制的所有记录神经元群体。(F) 根据波形最大值到最大值后最负峰值之间的延迟，将波形分为窄波（<225 微秒）和宽波（>250 微秒）。橙色和蓝色实线分别表示窄波和宽波群体的平均尖峰波形（浅橙色和浅蓝色为相应的均值标准误差）。插图展示了 32 个具有对称波形的小部分细胞的平均波形。(G) 全群体的放电率分布。(H) 宽波和窄波的累积分布函数。FWHM，半高宽。带相关 p 值的星号表示存在显著差异。另见图 S2。

随着时间的推移，观察到的神经元产量逐渐减少。这种现象可能由多种技术因素共同导致，包括电极定位（例如后期记录阶段部分四极管进入白质或位于脑室）、电极阻抗恶化以及物理损伤引发的四极管连接中断。尽管如此，即使在数月后仍能获得多个高质量的记录。在研究后期阶段，当识别出具有高信噪比的稳定神经元集群时，我们通过保持四极管位置不变的方式，实现了跨多日的连续性记录。在此类案例中，所记录集群的放电频率、刺激前后时间直方图及自相关图均表现出跨日稳定性。已识别集群的最长连续记录周期达48天（图S2）。

2.2. 皮层单神经元活动与双选择辨别行为的相关性研究为探究实验围栏内行为与神经活动的相关性，本研究采用双选择辨别行为范式，并配置自动测试装置（图1E与1H）。绵羊需接近围栏一端的装置，从两个自动呈现的刺激中选择正确选项（S+）以获得颗粒饲料奖励。若选择替代刺激（S−），则无奖励并伴随高频听觉提示。实验围栏另一端安装相同双选择辨别装置，两装置交替激活，迫使绵羊穿越围栏以获取后续奖励机会。基于此实验获取的皮层记录数据，研究人员探究了行为与神经活动的潜在关联。任务执行表现与既往绵羊行为学研究一致。尽管未对绵羊进行食物或水源剥夺，其仍表现出自愿参与性，并能每日习得新符号关联（图3A）。

图 3. 二选一辨别任务中与行为相关的单神经元特征

(A) 连续 6 天的连续二选一辨别任务表现。第 1 至 5 天对应于学习阶段（黑色线条；灰色线条是第 1 至 5 天的移动平均值），第 6 天（蓝色线条）对应于任务条件反转后的表现。(B) 在正确和错误试验中，接近选择点时的速度曲线。(C) 根据选择时间点之前的时间窗口内的群体放电率，对几个行为变量的解码准确率。解码器类型包括：(1) 移动与静止，(2) 任务类型（二选一辨别任务与刺激关联任务），(3) 移动速度，(4) 当前选择点的位置（4 个选择点中的 1 个），以及 (5) 正确选择与错误选择。红色数据点对应于 (D) 至 (K) 中绘制光栅图的实验时段。(D–K) 8 个示例细胞的光栅图（左侧）以及以选择时间点（t = 0 秒）为中心的相应试验平均放电率（右侧）。放电率图中较浅的灰色和橙色阴影表示平均值的标准误差。试验根据选择结果分组（黑色光栅表示正确；橙色光栅表示错误）。cv error，平均交叉验证误差。

我们从所有记录中选取了一部分，用于分析前面描述的行为，所选取的记录需同时记录了多个神经元，并且有足够的位置追踪数据，以便能够可靠地估计绵羊的移动速度。我们探究了在测量的行为变量中，哪一个最能预测这个大脑皮层区域的群体活动。这些行为变量包括 “任务类型”（一次只显示一个符号的简单二选一辨别任务，与传统的二选一辨别任务，即绵羊必须在两个符号之间做出选择）、“选择结果”（正确选择与错误选择）、“位置”（正在访问的奖励发放器的标识，也就是选择时间点的空间位置）、“移动速度”（如图 3B 所示）以及 “移动状态”（绵羊是否在移动）。从每个解码器的交叉验证误差（图 3C）可以看出，除了用于区分移动和静止状态的解码器外，大多数解码器的表现都很差。考虑到绵羊在这两种状态下预期处于不同的状态（例如，移动与享用奖励），这也许并不令人意外。这一观察结果也与在啮齿动物大脑皮层初级视觉区域的记录结果一致，在那里，移动速度和其他动作对行为的调节明显影响了这类初级感觉区域的活动。

在选择点附近，同时记录的皮层细胞的放电率各不相同，有些细胞在做出选择后放电率增加，而有些则降低。图 3D 至 3K 展示了在二选一任务执行过程中同时记录的 8 个细胞的示例，以决策点为零点绘制了光栅图。尽管每个细胞在接近正确和错误试验时的放电率都有其特征，但在做出选择后，其中一些细胞的放电率出现了差异。利用图 2 中详细描述的对细胞的假定分类，我们探究了这两类细胞群体是否受到行为任务的不同调节。我们计算了选择时间点之前（-4 秒到 - 2 秒）、期间（-1 秒到 + 1 秒）以及之后（+2 秒到 + 4 秒）2 秒时间窗口内的归一化放电率。威尔科克森符号秩检验表明，对于具有宽波形特征的神经元，选择前和选择后的神经元放电率与选择期间的放电率存在显著差异（选择前与选择期间：p = 1.7×10^(-5)，z = -4.29；选择后与选择期间：p = 0.023，z = -2.28）。然而，对于具有窄波形的假定中间神经元群体来说并非如此（选择前与选择期间：p > 0.70，z = -0.39；选择后与选择期间：p = 0.22，z = -2.26）。因此，尽管主要细胞可能受到任务阶段的调节，但中间神经元群体在不同任务阶段更为稳定。

2.3. 绵羊安静清醒状态和睡眠时的神经元特征

在静止的 “基线” 记录期间，绵羊表现得很放松，动作有限且没有挣扎。它们的眼睛有时闭上，但大多时候是睁开的。在此阶段，在大脑皮层（CTX）和海马体（HPC）中都观察到了与静止 / 不活跃状态相符的电生理特征（图 4 和图 5）。在大脑皮层中，我们观察到了显著的 α 波段（约 10 赫兹）振荡，而这种振荡在活跃行为期间是不存在的（图 4A）。这些振荡调节了局部的神经元放电活动，并且与海马体中的大尺度不规则活动同步发生（图 4B–4D）。两只绵羊在移动和静止 / 安静期间都表现出了相似的功率谱（图 4E 和图 S3）。海马体的锐波涟漪（SWR）振荡是高频振荡事件（>100 赫兹），已在许多哺乳动物物种中被观察到，并且与记忆巩固过程相关。在这里，我们首次证实，在绵羊静止时，锐波涟漪（SWR）也是其海马结构的一个显著特征（图 5A–5H）。这种网络振荡的两个组成部分，即由较慢的锐波成分以及约 150 赫兹的高频振荡共同构成的部分，在约 8000 个事件以及多个记录日中都很容易观察到。锐波涟漪（SWR）的平均持续时间约为 70 毫秒，而平均发生频率为每分钟 15 次（图 5D 和图 5E）。在海马体中，在锐波涟漪（SWR）期间，在涟漪峰值幅度时神经元放电的概率在统计学上显著更高（威尔科克森符号秩检验，Z 最小值 > 3.62，p<0.002；图 5F 和图 5H）。相比之下，在皮层神经元放电活动中未观察到此类调节（威尔科克森符号秩检验，Z 最大值 > 0.97，p>0.2；图 5G 和图 5H）。

图 4. 绵羊静止时在其大脑皮层中识别出的 α 波段振荡

(A) 同时从大脑皮层（CTX，左侧）和海马体（HPC，右侧）记录的示例频谱图。(B) 检测到 α 波段振荡事件期间的大脑皮层和海马体的局部场电位（LFP）。红色标记表示检测到的尖峰事件。(C) 关于 α 振荡相位的三个大脑皮层示例单元活动的极坐标直方图。(D) 大脑皮层中检测到的 α 波段振荡的自相关（左侧）及其在海马体中相应的活动（右侧）。(E) 大脑皮层（左侧）和海马体（右侧）在静止和移动状态下的归一化频谱功率。橙色表示移动期间；蓝色表示静止期间；实线代表绵羊 1 号的数据，虚线代表绵羊 2 号的数据。CTX，大脑皮层；HPC，海马体。另见图 S3。

图 5. 绵羊静止和睡眠时大脑皮层和海马体的电生理特征

(A) 海马体（HPC）中锐波涟漪（SWR）振荡的示例。(B) 锐波涟漪（SWR）的平均锐波成分（灰色线条；阴影区域表示标准误差均值）和平均涟漪成分（黑色线条）。(C) 从绵羊 1 号检测到的所有涟漪的涟漪触发平均频谱图。(D) 上图：涟漪振荡峰值重复率的分布（m = 155.1 赫兹，μ1/2 = 150.7 赫兹）。下图：涟漪持续时间的分布（μ = 69.1 毫秒，μ1/2 = 63.5 毫秒）。(E) 锐波涟漪（SWR）出现率的分布（m = 14.6 次 / 分钟，m1/2 = 15.0 次 / 分钟）。(F 和 G) 海马体（F）和大脑皮层（G）中单细胞活动的以锐波涟漪峰值触发的光栅图。(H) 海马体（蓝色线条）在锐波涟漪（SWR）期间有统计学意义的神经元放电活动，而大脑皮层（橙色线条）则没有。灰色区域表示经过邦费罗尼校正的统计学显著区域。蓝色星号表示统计学上有差异的时间区间（p = 0.0024，经邦费罗尼校正）。(I–L) 绵羊 2 号睡眠期间的皮层动力学。(I) 检测到的慢波振荡的示例。(J) 由慢波触发的大脑皮层频谱图。叠加的是平均慢波波形（黑色线条；平均波形周围的阴影区域是标准误差均值）。(K) 一个在 0 秒左右表现出明显抑制状态的细胞的示例光栅图。(L) 在检测到的慢波事件周围所有细胞的平均活动。CTX，大脑皮层；HPC，海马体。另见图 S4。

为了识别睡眠的电生理特征，我们对绵羊 2 号进行了整夜记录，在此期间，我们在大脑皮层（CTX）中观察到了显著的慢振荡（图 5I）。这些事件发生时，绵羊表现出所有入睡的迹象（侧卧、静止不动且眼睛闭上）。为了证实这些事件是否确实是非快速眼动（NREM）睡眠的局部慢波振荡，我们寻找了与这些睡眠事件相关的两个已知特征。首先，我们寻找与慢振荡锁相的纺锤波样事件（图 5J）。我们发现在慢波从负向转为正向的过渡阶段，约 20 赫兹的活动增强，这与在许多其他物种中观察到的丘脑皮层纺锤波一致。其次，我们检查了在慢波负峰值周围 2 秒时间窗口内的神经元放电活动的调节情况。结果显示，在负峰值附近（抑制状态），多单元神经元放电活动在统计学上显著减少（威尔科克森符号秩检验，Z 最大值 < -3.91，p < 0.001；图 5K 和图 5L）。最后，我们观察到了与快速眼动（REM）睡眠相符的睡眠时段，其特征是单细胞的放电率有增有减（图 S4）。

2.4. 自由活动绵羊的海马体动力学

在警觉状态下，海马体（HPC）在各个物种中一个明显普遍存在的特征是 4 至 10 赫兹的 θ 振荡。我们首次能够证明，在绵羊的海马体中很容易观察到这种节律以及 γ 波段振荡（图 6A），尤其是在活动期间（图 6A–6C；视频 S3 和 S4）。在啮齿动物中，移动速度是与 θ 振荡密切相关的行为特征。因此，我们探究了在我们的实验条件下是否也存在类似的相关性（图 6 和图 S5）。如图 6E 所示，在二选一辨别任务期间，速度分布呈双峰状，两个峰值之间的速度计数较少。因此，为了进一步分析，我们将速度数据分为三个区间（低速，<12 厘米 / 秒；中速，12–80 厘米 / 秒；高速，>80 厘米 / 秒）。我们计算了相应的平均频谱（图 6F），然后对 4 至 7 赫兹范围内的峰值功率进行了具有统计学意义的单因素方差分析（F (2, 2,443) = [4.361]，p = 0.0129），结果显示高速时的 θ 峰值功率显著高于低速时（p = 0.0103，95% 置信区间 = [6.85, 68.51]），而低速和中速之间以及中速和高速之间均未观察到统计学上的显著差异（p = 0.118 和 p = 0.745）。对 θ 功率的回归分析显示，其与速度或加速度的相关性较弱（R² = 0.22，p = 2.54・10^(-60) 以及 R² = 0.24，p = 1.29×10^(-144)）。在 10 至 13 赫兹频段内的峰值功率上观察到了更强的影响（单因素方差分析 F (2, 2,443) = 117.40，p = 2.07×10^(-49)，三个速度区间之间在统计学上均有显著差异（低速与中速：p < 0.01，95% 置信区间 = [7.15, 15.60]，低速与高速：p < 0.01，95% 置信区间 = [23.80, 32.86]，中速与高速：p < 0.01，95% 置信区间 = [13.02, 20.89]）。

图 6. 认知测试期间海马体的振荡动力学

(A) 认知测试期间海马体（HPC）频谱图的一个示例。图上方的黑色线条描绘了移动速度，频谱图上方的标记表示选择时间点（蓝色表示正确选择，红色表示错误选择）。(B) 速度曲线显示为在活动区域中位置的函数。数据对应于 (A) 中所示的时间间隔。(C 和 D) 分别为 (A) 中 500–600 秒时间段内 θ 波段（C）和 γ 波段（D）的放大图。黑色线条和标记如 (A) 中所述。(E) 直方图显示了速度分布，分为低速（蓝色）、中速（橙色）和高速（黄色）区间。(F 和 G) 三个速度区间中每个区间在 θ 频段频率（F）和 γ 频段频率（G）的平均功率谱。(H) 三个速度区间的共调制图。(I) 海马体局部场电位（LFP，黑色线条）和多单元活动（蓝色标记）在各种观察到大幅度 θ 振荡行为期间的示例，这些行为包括：(1) 用前蹄在活动区域墙壁上站立，(2) 注视实验人员，(3) 享用奖励，(4) 在活动区域外被约束，以及 (5) 在认知任务期间移动。(J) 在引导下穿越该区域时，头部朝上或朝下时的局部场电位（LFP，黑色）和假定的单神经元（红色标记）活动。(K) (J) 中所示神经元在头部朝上（蓝色）和头部朝下（红色）事件时的放电率。(L) 神经元放电活动的 θ 相位调制。所有频谱图和相位 - 幅度图都具有如图 (C) 所示的归一化（0–1）伪彩色标度。CTX，大脑皮层；HPC，海马体。另见图 S5 和 S6 以及视频 S3 和 S4。

已知 θ 振荡会组织更高频率振荡的功率。研究人员使用一种相位 - 幅度耦合量化方法，探究了这种现象在绵羊海马体（HPC）中是否存在（图 6G 和图 6H）。在低 γ 频率波段（30–50 赫兹，F (2,191) = 1.95，p = 0.1450）中不存在这种现象，但在高 γ 波段活动（55–90 赫兹，F (2,191) = 8.18，p = 3.91×10^(-4)）中存在，并且这种影响取决于移动速度（低速与中速相比：无显著差异，低速与高速相比：p < 0.001，置信区间 = [−0.0495, −0.0098]，中速与高速相比：p < 0.001，置信区间 = [−0.0454, −0.0057]）。此外，高于传统 γ 波段的更高频率振荡（90–150 赫兹）也强烈地表现出这种现象，但我们无法排除这种观察结果是由于局部场电位（LFP）受到尖峰污染而产生的可能性（详见图 S6）。

在某些情况下，当绵羊不移动时，也很容易观察到 θ 活动。为了进一步可视化 θ 振荡与行为的相关性，我们提取了在绵羊不移动时观察到 θ 振荡的时间段。这些时间段通常出现在行为任务的偶尔停顿期间，或者在觅食颗粒奖励的时候。与高功率 θ 振荡相关的行为片段包括用后腿站立、站着盯着实验人员、享用奖励以及某些被约束的情况（图 6I）。

最后，我们注意到一些神经元的放电活动受到实验步骤差异的调节（图 6J–6L）。例如，当绵羊在实验人员的引导下头部朝上穿越活动区域时，一个受 θ 调制的神经元会优先活跃。相反，在沿着相同路径引导穿越时，但这次头部朝向前方 / 下方，这个细胞的放电率较低（威尔科克森符号秩检验，Z <3.33，p = 8.7・10^(-4)；图 5J–5L）。

2.5. 绵羊表现出可 “重映射” 的空间调谐海马体细胞

除了已经描述过的 θ 和 γ 频段的振荡动力学之外，海马体活动的另一个标志是单个细胞的空间调谐。由于记录时间延长导致电极性能下降，我们在一只绵羊中仅识别出少量假定的海马体单神经元（n = 8）。尽管如此，在我们记录的 8 个已识别的海马体细胞中，有 7 个受到 θ 调制。此外，这 7 个细胞中的 6 个表现出具有方向偏好的空间调谐（图 7，细胞 1–5 和 7；图 S7，细胞 8）。也就是说，它们似乎是 “位置” 细胞。

图7. 绵羊海马单神经元活动具有空间调制特性并与θ振荡同步

(A) 左向运动轨迹的推定单神经元活动(B) 右向运动轨迹的推定单神经元活动(C) 各神经元θ相位偏好的极坐标直方图（红色箭头示合成矢量）(D) 单神经元自相关函数（红线标记θ频率对应延迟170 ms）。除神经元7外均显示θ相位调制。IC：信息量。**表示p<0.01水平显著性相位调制（所有示踪神经元均来自绵羊1）另见图S7

对于这些受到空间调制的海马体细胞中的一个，研究人员进一步探究了由于对记录活动区域的空间布局进行改变，其是否可能发生 “重映射”（图 S7）。在记录过程中，我们注意到当绵羊看向研究人员或者朝着研究人员的方向时，有一个细胞的放电活动会增多。我们想知道研究人员在多大程度上充当了一个显著的视觉线索，以及他们的存在是否能够调节位置细胞的活动。

因此，我们安装了一个屏障（活动区域墙壁的延伸部分），从活动区域内部遮挡绵羊对研究人员的视线（图 S7A–S7C）。在一次记录中，当绵羊执行认知任务时，我们记录了图 S7D–S7I 中所示位置细胞的持续活动情况（另见视频 S3）。我们首先在屏障放下且研究人员可见的情况下进行记录（图 S7A），然后在屏障升起（遮挡住研究人员；图 S7B）时记录，接着再次在屏障放下的情况下记录（图 S7C）。

我们观察到，当屏障升起时，这个单细胞的峰值放电率从 6.3 赫兹下降到了 1.3 赫兹。在放下屏障后，这个细胞的放电率恢复到了与第一次 “屏障放下” 记录期间相似的水平。因此，看起来这个细胞对绵羊可获取的视觉线索很敏感。这种变化是由于研究人员在场所具有的奖励性质，还是仅仅是一种与视觉感官相关的效应，仍有待进一步探究。有一种有趣的可能性是，这个细胞是在对人类研究人员所代表的 “社交” 线索做出反应。

三、讨论 近年来，大型动物在脑功能研究中的应用价值重新获得学界关注。这种趋势源于学界日益认识到猪、绵羊等大型动物作为临床前模型具有更高的转化潜力。本研究表明，对绵羊实施长达数月的深部脑记录具有可行性，这种宽时间窗特性使其成为研究神经退行性病变进展与长期治疗效能的理想模型。实验数据采集自非束缚状态绵羊（仅记录电极连接线限制），涵盖自然行为（静息、运动、觅食、睡眠）与实验室行为任务执行两种状态。通过同步记录皮层（CTX）与海马（HPC）数千个推定神经元活动，发现部分海马神经元具有空间位置调制特性，并在感觉线索改变时呈现放电率重映射现象。所记录神经元的电生理特征与非人灵长类高度相似，验证了绵羊作为温顺易控物种在纵向脑功能研究中的适用性。绵羊执行复杂认知任务的能力结合多点同步记录新技术，为解析觉醒"行为态"动物的脑功能机制开辟了新途径。

在生物学研究史上，绵羊作为内分泌学与生殖学研究的重要模式生物地位无可替代，但其在脑功能神经生理学领域的应用尚不充分。近期研究通过脑电图技术揭示了绵羊睡眠动力学特征及神经活性药物的影响。在更高分辨率层面，研究人员发现成年绵羊及羔羊皮层V1、V2区神经元存在方位调谐特性，并解析了面部识别能力相关的神经环路机制。然而这些在体研究均在头部固定或麻醉状态下完成。本研究旨在证明绵羊在觉醒/非束缚"行为态"单神经元记录研究中的潜力。通过识别海马与皮层中已知电生理特征（啮齿类、灵长类及人类研究中确立），包括认知任务执行期与自然行为期的特征信号，完成技术面部效度验证。采用成熟可靠的四极管可调电极阵列技术，我们实现了局部场电位（LFP）与多神经元活动的长期稳定记录，证明该技术适用于需要长期记录的纵向特征研究。未来研究可考虑采用硅探针等新型技术，其低剖面特性利于深部脑结构靶向，但需权衡记录稳定性（可通过非刚性固定颅骨式探针优化）。本研究首次揭示绵羊海马功能电生理特征与该脑区已知特性高度吻合：观察到显著θ节律振荡及其行为相关性。与啮齿类θ振荡主要关联运动状态不同，绵羊θ振荡还与注视固定等多状态相关，此现象在非人灵长类中亦有报道。此外，发现γ波段振荡嵌套于慢θ振荡相位，且γ活动与运动速度相关，与啮齿类研究结果一致。

值得注意的是，θ 节律和锐波涟漪（SWR）振荡的频率低于在啮齿动物中观察到的频率。这与随着大脑体积增大，这些振荡的主导频率降低的情况相一致。尽管较低的 θ 频率有可能是由于绵羊在我们的实验活动区域内能够达到的速度范围有限，或者是因为电极的位置在海马体 CA1 区的中间部分，而不是在背侧 CA1 区（在啮齿动物中，速度与振荡的相关性大多是在这个海马亚区被报道的），但后一种解释与较低频率的涟漪不一致，因为在啮齿动物海马体的腹侧，涟漪的频率似乎更快。无论原因是什么，这两个发现（较低的 θ 频率和涟漪振荡频率）在转化医学方面都具有重要意义，因为在对人类受试者的海马体记录中也观察到了较低的 θ 和涟漪频率节律。

在海马体中，我们不仅观察到了受位置调节的假定神经元，还观察到了一个在感觉线索被改变后出现放电率重映射的细胞。这扩大了被认为海马体与空间或情景记忆有关的物种范围。绵羊海马体中存在位置神经元本身并不令人惊讶，但它们的存在开辟了新的发现视野。对受空间调节的神经元进行研究，会受到能够测试动物的环境维度的限制。当使用非人类灵长类动物而非啮齿动物时，这尤其具有挑战性，因为它们不仅体型更大，而且它们的自然行为是在三维空间中发生的。绵羊主要在二维空间中移动；因此，捕捉它们行为的技术挑战相对减少。使用绵羊进行此类研究还有许多其他优势。由于绵羊温顺且容易被传统的农场围栏圈养，它们不仅有可能在大空间中被研究，还可以在社交环境中的群体中进行研究。通过研究绵羊，可以更好地理解母性行为的神经基础。例如，无论是在动物还是人类中，对母体排斥行为的潜在机制都了解甚少，但在绵羊中却很容易进行研究，因为母羊排斥小羊的情况很常见。同样，作为驯化的群居动物，绵羊有频繁的社交互动，并且与同类和人类都有关系。种间关系尤其引人入胜。例如，我们记录到的那个受饲养员视觉刺激调节的细胞，有可能是假设的 “祖母细胞” 的一个例子。尽管我们无法从我们的研究中得出视野中的什么因素调节了这个神经元的放电，但鉴于绵羊与它们的饲养员建立了密切的关系，这可能是研究此类神经元存在的理想物种。此外，绵羊能够轻松地执行测量决策能力的复杂认知任务，并且可以研究的行为范围很广泛。因此，这为研究颞叶的记忆机制或空间编码特性提供了一个有趣的机会。这些研究可以是大规模的，不仅在神经空间方面（因为绵羊大脑的体积）和物理空间方面（因为绵羊可以在正常实验室环境的限制之外使用），而且在群体规模方面。

这里描述的所有记录都发生在外侧回的前后中间范围，从覆盖海马体背侧的顶枕第三回记录到的假定细胞数量最多。尽管目前还没有绵羊大脑详细的功能解剖图谱，但先前的研究表明外侧回与初级视觉功能有关。在我们的研究中，我们观察到在区分移动和静止状态（在二选一辨别任务中享用奖励期间）的行为状态时，解码准确率最高。因此，我们认为绵羊的这个脑区参与了感觉运动处理。这一点还需要进一步研究来阐明。

虽然我们的研究展示了大规模电生理记录的潜力，但它也为在自然和社交环境中的动物身上进行成像研究提供了可能性。绵羊能够佩戴大量的头戴式设备，并且它们不会干扰这些设备，这一能力带来的机会使得一些在灵长类动物或啮齿动物身上可能无法进行的研究得以开展。像绵羊这样的大型动物开始产生影响的另一个研究领域是治疗干预措施的测试，比如针对神经退行性疾病的基因疗法。使用绵羊既可以应对 “扩大” 到更大脑体积的挑战，也可以解决获取实验对象的问题，因为在大多数国家都很容易获得绵羊。

总之，我们在此证明了使用绵羊作为一种大脑体积较大的哺乳动物进行单神经元分辨率的纵向电生理研究的实用性，并描述了其巨大的潜力。这种方法只是一个例子，但如果使用更现代的电生理工具进行扩展，在大型不受约束的哺乳动物身上进行大规模大脑活动监测的机会是前所未有的。我们认为，尽管这个物种不会取代常见的实验室物种，但它可能在加速理解正常和异常大脑功能的研究进展方面发挥独特的作用。

四、开始★方法

关键资源表

4.1. 资源可用性

4.1.1. 材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

4.2. 实验模型和研究对象详情

4.2.1. 动物

本研究使用了两只威尔士山地绵羊（植入时分别为 17 个月和 19 个月大的母羊，植入时体重分别为 35.0 千克和 36.0 千克，实验结束时体重分别为 45.5 千克和 45 千克）。两只羊均来自剑桥大学的羊群。所有操作程序均按照英国《动物科学程序法案》（1986 年）以及剑桥大学动物福利和伦理审查机构（AWERB）的规定进行。

4.2.2. 方法详情

4.2.2.1. 动物训化

在手术前的几周里，研究人员对绵羊进行了常规的照料。它们接受了用牵引绳行走的训练，以便使其适应人类饲养员，并且在与羊群隔离时也能感到舒适。两只绵羊在饲养员在场的情况下，都乐意在与同类隔离的状态下参与实验。

4.2.2.1. 手术程序

绵羊在手术前禁食一夜。使用静脉注射阿法沙龙，剂量为 3 毫克 / 千克来诱导麻醉，并通过曼利呼吸机以 2%-3% 的异氟烷维持麻醉状态。在整个手术过程中，呼气末二氧化碳分压和平均动脉血压分别保持在 25-30 毫米汞柱和 70-90 毫米汞柱之间。在整个手术过程中，定期记录生命体征。以 5 毫升 /（千克・小时）的速度静脉输注液体。使用无菌技术暴露颅骨背侧表面，并使用骨刮刀清除任何结缔组织。用 3% 的过氧化氢清洁颅骨，用无菌生理盐水冲洗，然后去除任何残留的结缔组织。在右半球，从额骨和后脑骨的交点向后 9 毫米、外侧 8 毫米处钻一个 15 毫米 ×15 毫米的颅骨切开术切口。颅骨切开完成后，在精心选择的位置使用硬脑膜切开工具切开硬脑膜，以避开任何血管。在能够看到大脑皮层的情况下，在外侧回大约前三分之一处且血管很少或没有血管的位置选择植入点。由于发现软脑膜也会阻碍四极管的穿透，因此也将其切开。这是在显微镜下使用电灼显微镊子完成的。如果出现出血情况，将明胶海绵短暂地敷在颅骨切开处。使用立体定位操纵器将微推进器植入物降下到位，使大套管的底部非常靠近大脑表面（距离小于 1 毫米）。然后通过一个不锈钢螺丝将接地线连接到颅骨上。此时，启动数据采集，并将电极推进 1-2 毫米进入大脑皮层的第一层。这被认为是必要的，以确保在将植入物永久固定到颅骨上之前，电极能够自由移动。一旦确认穿透，用可吸收止血剂填充颅骨切开处，擦干任何脑脊液，然后用含庆大霉素的牙科丙烯酸树脂密封。在涂抹丙烯酸树脂之前，让其粘度增加，以避免通过可吸收止血剂层渗漏的可能性。将四极管微推进器固定在颅骨上后，使用不锈钢螺丝将电极驱动腔室连接到颅骨上，然后用牙科丙烯酸树脂覆盖。最后，使用水平缝合和荷包缝合技术缝合伤口。最后，使用伤口喷雾敷料密封伤口。所有侵入性操作完成后，将绵羊的头部从立体定位框架上取下，并停止使用异氟烷、一氧化二氮和间歇正压通气。在手动辅助呼吸的同时保持氧气流通，直到绵羊开始自主呼吸。然后将绵羊放置在一个有软垫墙壁的恢复区，当麻醉师认为合适时，取出插管。一旦绵羊清醒到能够站立，就给它喂食颗粒饲料，然后将其送回原来的生活环境。在当天剩余的时间里，定期对绵羊进行监测。每只绵羊术后接受为期四天的抗生素治疗（青霉素，Depocillin，15 毫克 / 千克）、非甾体抗炎治疗（卡洛芬，Rimadyl，4 毫克 / 千克，每天一次，持续 2-3 天）和止痛治疗（丁丙诺啡，Vetergesic，0.01 毫克 / 千克，每天一次，持续 2-3 天）。此外，在手术后的 24 小时内给绵羊注射单剂量的地塞米松。有关动物驯化和手术技术的更多详细信息可在其他地方找到。

4.3. 电生理记录

4.3.1. 植入物准备

研究人员使用了定制的四极管微推进器，与研究人员描述的类似。主要区别在于，行程距离设置为 2 厘米，因此需要更长的螺丝和套管来适应额外的行程。四极管由直径 12.5 微米的镍铬合金丝手工组装而成，并用 1/4 Hard PAC涂层。电极装入微推进器后，将其连接到 Neuralynx 接口板上。手术前两天，对电极进行镀金处理，使其目标阻抗达到 250kΩ，适合进行尖峰检测。为了保护四极管微推进器免受外力影响，使用了一个电极腔室。要求该腔室能在四极管微推进器固定到位后轻松安装。因此，腔室由三部分组成：一个盖子和一个两部分的卡扣式锥形腔室（图 1B）。腔室由聚酰胺通过 3D 打印制成，并通过几个不锈钢法兰固定在颅骨上。

4.3.2. 电极移动

手术结束后第 4 天（绵羊 1）和第 7 天（绵羊 2），开始移动电极。用 Gambrel 约束器固定绵羊，并通过间歇性给予食物颗粒鼓励其保持静止。然后，每天将电极推进 150 - 300 微米。手术后 7 - 10 天，开始每天进行记录。每次记录结束时，推进四极管，直到它们最终到达海马体。继续从留在大脑皮层浅层的四极管以及已深入到海马结构的四极管采集局部场电位和单细胞数据。

4.3.3. 行为测试装置

所有记录都在一个大型黑暗的农场棚内进行，棚内有一个特制的空间活动区域（图 1F 和 1G），尺寸为 2.2 米 ×6.6 米。活动区域长边的两端各安装了一套自动端到端二选一辨别装置。该装置由四台电脑显示器、四个光学传感器、四个自动颗粒奖励分配器和一个数字采集设备组成。通过专用计算机上的 Matlab脚本对这些设备进行控制。通过同一个采集设备，将数字标记发送到神经记录设备，以便为神经数据流添加时间戳，与光学传感器触发、奖励分配和喂食器标识相对应。研究人员描述了这种行为测试装置的一个变体，它实现了一个单一的二选一辨别任务。使用 Digital Lynx SX 系统（Neuralynx 公司，美国蒙大拿州博兹曼市）进行电生理记录。所有四极管通道的采样率为 32kHz，在线提取尖峰并以 32kHz 的采样率保存，同时每个四极管中的一个电极用于以 8kHz 的采样率采集局部场电位。定制的电池驱动 LED 灯安装在绵羊头部，用于跟踪。使用四个高架摄像机（Jai CV - 3200 NTSC，配备富士胶片 DF6HA - 1B 6mm 镜头）跟踪绵羊在活动区域内的位置。摄像机采样率为 25 帧 / 秒，使用 Neuralynx VTS 软件跟踪绵羊的位置。生理和行为采集计算机通过 Digital Lynx SX 系统的外部 TTL 端口进行同步。

4.3.4. 行为测试

在大多数记录时段，绵羊要完成几个任务，主要围绕二选一辨别任务展开。为了鼓励绵羊在记录活动区域内移动，以获取与运动和空间编码相关的神经数据，研究人员使用上述设备在活动区域最长边的两端各设置了一套二选一辨别装置。活动区域的每一端都有两台电脑显示器、自动颗粒分配器和光学传感器，构成一个二选一辨别装置。每个装置按顺序激活。绵羊做出选择（正确或错误）后，经过约 7 秒的短暂延迟（无论选择结果如何，延迟时间固定），刚使用过的装置会停用，屏幕变黑，发出提示音，活动区域另一端的装置会激活，显示刺激并启动光学传感器。因此，为了获得下一次获得奖励的机会，绵羊必须穿过活动区域（没有超时限制），并通过触发光学传感器做出选择。使用这种设置，动物每次记录至少能可靠地完成 40 次试验，相应地，会穿过活动区域 40 次。此外，还对绵羊进行了应急情况反转测试（之前错误的选择变为有奖励的，反之亦然），以及一个更简单的刺激关联任务测试，即任何符号与空白屏幕相比，选择前者为正确选择。在一些试验中，绵羊会参与空间探索任务，在活动区域地板上寻找作为奖励撒下的食物颗粒。在每次记录时段开始和结束时，都会记录绵羊静息但清醒状态下的活动，因为在此期间绵羊必然会被固定，以便连接或断开电缆和前置放大器。在这个记录阶段，研究人员会寻找与静止状态相关的特征，如海马体中的锐波涟漪振荡或新皮层的 α 波段振荡。还对每只绵羊进行了整夜的电生理记录。

4.3.5. 典型记录时段流程

在一个典型的记录时段，绵羊会被牵着转移到装有记录区域的棚内，或者自愿跟随研究人员进入棚内。在棚内但在活动区域外，用 Gambrel 约束器固定绵羊。通过头戴式前置放大器将电极连接到记录设备上，并安装一个保护罩来容纳前置放大器组件。将 LED 灯安装在绵羊头部的背面，进行 5 分钟的基线记录。然后，将绵羊引导进入实验活动区域，开始进行行为测试。通常，绵羊会进行 80 到 100 次二选一辨别试验，有时试验中会包含应急情况的反转。最后，将食物颗粒撒在活动区域的地板上，以鼓励绵羊前往在二选一辨别任务中它原本不会去的区域。

4.3.6. 组织学检查

在实验结束时，对绵羊实施安乐死，并检查它们的大脑以确定电极的位置。给绵羊注射致死剂量的戊巴比妥，确认死亡后，对颈静脉进行插管并用 2 升生理盐水冲洗。然后，用 4% 的多聚甲醛固定大脑。接着，将大脑从颅骨中取出，浸泡在 4% 的多聚甲醛中一个月。之后，将其转移到冷冻保存溶液（20% 的蔗糖溶液）中。去除覆盖在大脑皮层和小脑的所有膜，将大脑切成两个半球，并在四极管穿透区域周围进一步分割，以便蔗糖能更快地渗透。然后，将组织切成 60 微米厚的切片，每隔一片切片用甲酚紫染色或用胶质纤维酸性蛋白进行免疫染色。前者用于观察电极轨迹，后者用于检查是否存在反应性星形胶质细胞增生（图 S1）。

4.4. 量化分析与统计学处理4.4.1. 数据分析采用Matlab平台（自定义脚本及Chronux等工具箱）进行数据分析。将四路视频追踪信号手动拼接为连续轨迹。尖峰排序使用MClust v4.4完成，基于幅度与主成分特征人工校订集群，剔除不应期受污染的集群。解码分析采用8秒时窗（100ms分箱）内皮层细胞在决策点附近的放电频率数据，按独立实验批次实施线性判别分析（Matlab内置函数fitcdiscr，参数设定：对角协方差矩阵，10折交叉验证）。以交叉验证误差（kfoldLoss函数）作为模型比较指标，预测因子在100ms窗口内平均。数据均以均值±标准误呈现（特别说明除外）。

4.4.2. 电生理事件检测海马涟漪检测：选取海马定位四极管，对局部场电位（LFP）进行100Hz高通滤波及z分数标准化，通过平滑整流希尔伯特包络检测大振幅事件（z>3SD）。同步检测15Hz低通滤波LFP的尖波事件。采用Chronux的mtspectramc函数计算事件中心频谱图（锥形参数3与5，窗长150ms）。

静止期α振荡检测：使用皮层四极管窄带滤波（6-12Hz）z分数LFP，阈值设定z=3SD，双侧局部搜索确定事件边界，合并重叠事件。按行为状态（围栏内任务 vs 围栏外限制）量化检测结果。慢波振荡检测采用z分数低通滤波（<3Hz）皮层LFP（对比海马数据），阈值z=5SD。以1.5s窗长（锥形参数1,3）计算负峰周围多锥触发电频谱。海马θ/γ振荡与运动速度的关联性通过fitlm函数线性回归分析。跨频耦合采用调制指数法，经1000次相位随机化数据校正。通过窄带LFP信号峰谷插值评估振荡相位对尖峰的调制作用。

海马细胞空间调制分析：以25cm²分辨率计算空间占据率及对应区室尖峰总数，经占据率归一化后采用标准差0.3的二维高斯核平滑处理，剔除低占据区室（<0.3s）。使用信息量指标量化细胞空间选择性。

4.4.3. 统计学方法

对于涉及不同实验条件下细胞活动的统计检验，采用针对匹配样本的威尔科克森符号秩检验。当比较的数据集超过两组时，则使用单因素方差分析，随后进行经邦费罗尼校正的成对 t 检验。

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